His-tag标签蛋白纯化磁珠（镍磁珠） —使用说明书
试剂盒组成
产品编号 | 规格 |
BMNI-5 | 5 mL |
BMNI-50 | 50 mL |
试剂盒储存条件及稳定性
His-tag标签蛋白纯化磁珠（镍磁珠）4~8℃保存即可，在适合的储存条件下该磁珠使用有效期为1年。
产品简介
BioMag成功研发出的His-tag标签蛋白纯化磁珠（镍磁珠），主要用来小批量纯化和筛选组氨酸标记的蛋白。这类产品的优势在于菌体被破碎后，无需对菌体碎片进行离心分离就能进行纯化，因此能够大幅缩短纯化过程所需时间，适合于对大量样品的纯化。另外，除了能够纯化可溶性的His-tag融合蛋白质，还能通过添加化学元素胍，纯化出如包涵体融合蛋白质，疏水性融合蛋白质等其它His-tag融合蛋白质。
产品特点
1. 操作简单，可重复使用
2. 可分离出高纯度、高产率的蛋白
3. 纯化过程可放大
4. 磁性较强，可被外磁场迅速的捕获
5. 磁珠粒径均一，分散效果好。
磁珠参数
基质 | 聚甲基丙烯酸酯磁性微球 |
粒径 | 30μm |
配体 | Ni |
含量 | 10%（体积比） |
结合力 | 每毫升磁珠至少可结合5mg组氨酸标记的蛋白 |
重复使用次数 | 10次以上 |
| 最高耐受温度 | <150℃ |
保存 | 2~8℃，20%乙醇水 |
用途
His-tag标签蛋白纯化磁珠（镍磁珠）主要是用来简化组氨酸标记的蛋白的小批量纯化和筛选。
操作步骤
I. 缓冲液的准备
目标蛋白与His-tag标签蛋白纯化磁珠（镍磁珠）的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，而各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合纯化目标蛋白的缓冲液体系，主要包括结合缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。
以下提供的缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，以供参考。
（1）结合缓冲液：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，5~50 mM Imidazole，pH7.4
（2）洗涤缓冲液：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，50~100 mM Imidazole，pH7.4
（3）洗脱缓冲液：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl， 500 mM Imidazole，pH7.4
II.样品处理
（1） 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：按每克细胞加入蛋白酶抑制剂，重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，用户也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。
（2） 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量结合缓冲液稀释，即为粗蛋白样品。
（3） 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS（自备）洗涤1次，弃上清，用适量含1%（v/v）Triton X-100或1%（v/v）NP-40的结合缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，置于冰上10 min，即为粗蛋白样品。
III. 磁珠预处理
（1） 将His-tag标签蛋白纯化磁珠（镍磁珠）置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取适量的磁珠悬液于离心管中，进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管。
（2） 加入相同体积的结合缓冲液到上述装有磁珠的离心管中，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，移去上清液。重复洗涤2次。
IV. 目标蛋白与磁珠结合
以纯化大肠杆菌表达的组氨酸标签蛋白（2g湿重菌体预估目标蛋白产量为10~20 mg）为例说明蛋白纯化操作。
（1） 用10 mL 结合缓冲液悬浮2g湿重的菌体，进行破碎和裂解之后，即为目标粗蛋白样品，加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15s。
（2） 将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合20~30 min（如果需要，可以在2~8℃的低温环境下旋转混合1h，防止目标蛋白降解）。
（3） 将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液至新的离心管中以备后续检测，从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。
（4） 加入相同体积的结合缓冲液到上述装有磁珠的离心管中，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，移去上清液。重复洗涤2次。
V. 磁珠洗涤
（1） 加入10 mL 洗涤缓冲液到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测。重复此述步骤1次。
（2） 加入10 mL 洗涤缓冲液到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管（避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白），磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。
Ⅵ. 目标蛋白洗脱
（1） 用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度，加入2~10 mL 洗脱缓冲液，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品。
（2） 如果需要，可以重复上述步骤1次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。
（3） 通过SDS-PAGE或Western blotting检测目标蛋白。如果需要测定蛋白质浓度，可以采用洗脱缓冲液洗脱再进行测定，或者采用透析、超滤等方法去除Imidazole后再进行浓度测定。
